Abbildung1: Skizze einer cilierten respiratorischen Epithelzelle (links) und schematischer Cilienquerschnitt (rechts).

Bei der Immunfluoreszenzdiagnostik (IF) werden Bestandteile (Proteine) diverser Cilienstrukturen durch spezifische Antikörper markiert und angefärbt. Der Querschnitt einer normalen Atemwegscilie zeigt die typische Anatomie des Axonems, welches aus 9 peripheren Tubulin-Doppelröhren besteht, die um 2 zentral gelegene Einzelröhren angeordnet sind (9+2-Struktur). An den peripheren Tubuli sind die radial ausgerichteten Speichen sowie die inneren und äußeren Dyneinarme verankert (Abbildung 1). Die äußeren und inneren Dyneinarme sind Proteinkomplexe und bestehen aus verschiedenen Dyneinketten und assoziierten Proteinen. Die Mutation eines der Gene, die für die Bestandteile der Dyneinarme kodieren, hat häufig den Verlust des gesamten Dyneinarmes zur Folge.
Dies ist auch in der Elektronenmikroskopie erkennbar, allerdings ist der innere Dyneinarm aufgrund seiner Kontrastarmut in der EM nicht so gut darstellbar wie in der IF. Als Material für eine EM wird meistens ein Zangenbiopsat verwendet, dessen Entnahme eine Bronchoskopie erfordert. Diese Methode, die oft unter Narkose erfolgt, ist für den Patienten wesentlich belastender als der für die IF benötigte Nasenschleimhautabstrich (Bürstenbiopsat).

Abbildung 2: Immunfluoreszenzmikroskopie respiratorischer Epithelzellen. Darstellung eines Bestandteiles des äußeren Dyneinarmes (rot) und des Tubulus (grün). Der Zellkern ist blau angefärbt. Die gelbe Farbe zeigt die räumliche Nähe (Ko-Lokalisation) der Proteine an. Von links nach rechts: Kernfärbung (blau), DNAH5 (rot), acetyliertes alpha-Tubulin (grün), Fusion (gelb = Ko-Lokalisation), Durchlicht. Oben bei einem gesunden Probanden, unten bei einem PCD-Patienten mit fehlendem äußeren Dyneinarm.

Der Nasenschleimhautabstrich erfolgt mit einer kleinen Bürste, die einige Zentimeter tief in die Nase eingeführt wird um respiratorische Epithelzellen abzustreifen. Diese Gewebsentnahme ist relativ einfach durchzuführen, dauert nur wenige Sekunden und verursacht außer einem heftigen Niesreiz keine Beeinträchtigung des Patienten. Die Epithelzellen werden auf Objektträgern ausgestrichen und für die Immunfluoreszenzmikroskopie präpariert. Die Immunfluoreszenzfärbung dauert mehrere Stunden, der Aufbau ist schematisch in Abbildung 3 dargestellt. Zuerst wird die Probe auf dem Objektträger fixiert, danach erfolgt eine Behandlung zur Vermeidung unspezifischer Antikörperbindung (Blockierung). Im Anschluß wird der spezifische primäre Antikörper (I.) dazugegeben, welcher ein bestimmtes Protein (schwarzes Sechseck) erkennt und daran bindet. Danach erfolgt die Inkubation mit dem Flureszenzfarbstoff-gekoppelten, sekundären Antikörper (II.), welcher an den primären Antikörper koppelt. Zum Schluss werden die Zellkerne direkt durch einen Farbstoff markiert und das Präparat in einem speziellen Medium eingebettet. Zwischen den einzelnen Schritten ist ausgiebiges Waschen erforderlich. Das fertige Präparat wird unter dem Immunfluoreszenzmikroskop betrachtet. Der Farbstoff wird dabei von einem Laser angeregt (blaue Wellenlinie) und emittiert eine spezifische, vom Gerät detektierte Wellenlänge. Die Meßdaten können als Einzelfärbungen und, bei Mehrfachfärbungen, als berechnete Überlagerung angezeigt werden. Der zur Darstellung des äußeren Dyneinarmes erforderliche, spezifische anti-DNAH5-Antikörper wurde von unserer Arbeitsgruppe hergestellt und ermöglichte uns die Entwicklung und Etablierung dieser Diagnostikmethode. Auch die Darstellung des inneren Dyneinarmes ist mittlerweile etabliert, an weiteren Antikörpern und der Färbung anderer Bestandteile der Cilie wird gearbeitet.
Die IF-Diagnostik ist sehr aufwendig. Bei einem Patienten ist die Verdachtsdiagnose PCD und die Durchführung dieser Analyse berechtigt, wenn folgende Symptome gemeinsam vorliegen:

Abbildung 3: Schema Immunfluoreszenzfärbung, Erklärung im obenstehenden Text

  • RDS-ähnliches Bild im Neugeborenenalter
  • rezidivierende, schwere Infektionen der Atemwege
  • chronischer, produktiver Husten
  • rezidivierende otitis media
  • Entwicklung von Bronchiektasen (im Kindes- bis Jugendalter)

-------------------------------------------------------------------------------------

  • situs inversus und chronische Atemwegserkrankungen (Kartagener-Syndrom)

Die Diagnostik wird in unserem Labor in Münster durchgeführt. Weitere Informationen und Unterlagen finden Sie in den folgenden links oder wenden Sie sich direkt an unser Labor in Münster, wir senden Ihnen ein Kit zu. Eine zusätzliche Teilnahme an unserer genetischen Studie würden wir begrüßen.


Informationen und Unterlagen zur Immunfluoreszenz-Diagnostik (Bürstenbiopsie)

Protokoll der Bürstenbiopsie (für den behandelnden Arzt)     

            
Begleitbogen für die Bürstenabstriche

            
Link zu unserer "genetischen Studie"

      
Weiterführende Literatur