Bei der 4Pi-Mikroskopie wird die hohe Auflösung entlang der z-Achse durch zwei sich gegenüberliegende Objektive erzielt. Durch diese Konfiguration wird der Fokus gegenüber der konventionellen konfokalen Mikroskopie um einen Faktor 57 verringert.

Unser Mikroskop, ein kommerzielles Mikroskop vom Typ A (TCS, Leica Microsystems), ist eines der wenigen 4Pi-Mikroskope weltweit.

Es basiert auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop vom Typ TCS SP2, welches um einen 4Pi-Kopf erweitert wurde. Es ist wahlweise eine Ein- oder Zweiphotonenanregung möglich. Die Detektion kann über Avalanche-Photodioden oder über einen Photomultiplier erfolgen. Für die Zweiphotonenanregung wird ein modengekoppelter Titan:Saphir-Laser (MaiTai, Spectra Physics) verwendet.

Das Mikroskop kann unter Verwendung von Öl- (100x, NA 1.46) oder Wasser-Immersionsobjektiven (63x, NA 1.2) betrieben werden. Es wird eine axiale Auflösung von 100–120 nm mit Öl-Immersionsobjektiven bzw. 150–170 nm mit Wasser-Immersionsobjektiven erzielt. Die Lokalisierungsgenauigkeit liegt bei 10 nm.